A coloração é uma técnica citológica utilizada em microscopia ótica que utiliza corantes com o objetivo de evidenciar diferentes partes na preparação.
A coloração tira partido de os diferentes corantes atuarem de forma desigual sobre s várias zonas celulares. Os corantes ácidos (ex.: fuchsina ácida, eosina), por exemplo, atuam preferencialmente sobre o citoplasma da célula, enquanto que os corantes básicos (ex.: fuchsina básica, azul de metileno) atuam especialmente sobre o núcleo.
Coloração Simples
A coloração simples tem bases físico-químicas. A impregnação de uma célula por um corante pode ser entendida a partir de fenômenos como a capilaridade, osmose, adsorsão e absorção. Mas, é sobretudo pela compreensão de certas reações de corantes de organóides, inclusões e estruturas celulares que firmam as bases desta metodologia. Desta forma é observada uma reação estequiométrica entre corantes e uma dada estrutura, por força da afinidade de suas cargas opostas.
material: material biológico em suspensão, lâminas, lamínulas, microscópio, pipeta Pasteur (ou conta-gotas), corante (azul de metileno, verde malaquita, Giemsa, etc).
método: fazer um esfregaço com o material biológico. Esperar secar. Fixar ao calor. Cobrir o esfregaço com o corante. Esperar por 1 a 5 min. Lavar com água, secar e observar ao microscópio com abjetiva de imersão.
Preparação das Lâminas - Coloração Simples
Questões:
1. Os
meios de cultivo e a idade da colônia exercem alguma influência na morfologia
de células em coloração simples?
Sim, pois a forma das bactérias depende
das condições fisiológicas dentro de um certo limite de viabilidade celular.
2. A
coloração simples se presta a identificação de uma cultura mista de
microrganismos? Que observações poderiam ser obtidas?
O objetivo é apenas tornar a forma e estrutura básica das células mais
visíveis. É mais frequentemente usada na verificação das características
morfológicas das bactérias. Apresenta vantagens como: células mais facilmente
visíveis após coloração, podem ser evidenciadas diferenças entre células de
diferentes espécies ou dentro da mesma espécie pelo uso de soluções corantes
apropriadas.
3. Qual
a aplicação da coloração simples no Diagnóstico Laboratorial de doenças
infecciosas?
O objetivo dessa coloração no quadro de infecções é poder mostrar todo o
microrganismo e suas particularidades como formas e estruturas básicas.
4. Cite
exemplos de Doenças Infecciosas e seu agente infecioso que são diagnosticados
seguramente pela uma coloração simples?
Histoplasma capsulatum nos fagócitos e nas células teciduais, parasitas no
sangue, inclusões intracelulares formadas por vírus e clamídias, Trofozoítos de
Pneumocystis jirovecii, algumas bactérias intracelulares.
5. Cite
alguns cuidados, a serem tomados para a execução satisfatória da coloração
simples.
O manejo correto do esfregaço, que deve estar fixado e coberto com a solução
corante por aproximadamente cinco minutos, após o qual a lâmina é lavada com
água e devidamente seca. As células geralmente se coram uniformemente. Usar um
dos corantes: Cristal violeta, azul de metileno, safranina. Atentar-se para o uso
de máscara, luva e touca para não contaminar o material biológico.
Coloração de Gram
Questões
1.
A coloração de Gram possibilita caracterizar as
bactérias quanto ao comportamento tintorial (Gram- positiva e Gram-negativa), morfologia (cocos, bacilos,
espirilos) e arranjo (em cacho, em cadeias, aos pares). Qual o significado destas
informações para a medicina?
É importante
porque auxilia no diagnóstico e tratamento das doenças infecciosas.
2.
A coloração de Gram exerce alguma importância em
diagnósticos clínicos de bactérias isoladas de
infecções humanas e animais? Citar pelo menos um exemplo.
SIM, Algumas
bactérias, tais como a NEISSERIA, apresenta características peculiares. Assim o
achado de diplococcus Gram-negativos, intra e extracelulares em secreções pode
sugerir uma GONORRÉIA, no caso da secreção uretral, ou uma MENINGITIDE, no caso
do material for um LIQUOR.
3.
Empiricamente, Gram estabeleceu uma sequência para a
aplicação dos corantes que integram a metodologia.
Comentar os resultados possíveis de serem obtidos com as inversões da sequência referida
no método.
Os microrganismos
reagem de forma diferente ao método. Há pessoas que ainda retêm o pigmento
característico do corante (cristal violeta) devido à complexação com solução de
iodiodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, fazendo com que a
parede celular fique desidratada, reduzindo o grau de porosidade e permeabilidade. São Gram positivos. E há
tipos que permitem a remoção do pigmento colorante por lavagem com álcool ou
acetona, retirando a gordura da parede, levando ao aumento da porosidade
celular. Estes são Gram negativos. Ao tratar os dois grupos com um agente
anti-coloração (safranina básica ou fucsina), observou-se que as células do
primeiro grupo (Gram-positivas) não foram afetadas e permaneceram azuis ou
roxas; enquanto para outras células
(Gram negativas), as células absorvem o contraste, tornando-as vermelhas.
4.
Sabe-se que se a parede celular é o sítio preferido
pela fixação da reação de Gram. Fazer um esquema mostrando esta associação, para o caso típico de uma bactéria Gram-positiva.
A parede celular
bacteriana possui características especiais em sua composição química. Esses
dados coincidem completamente com a resposta para a reação de Gram. A presença
de um maior teor de peptidoglicano em bactérias Gram-positivas mostrou ser um
determinante da manutenção do complexo ao nível da parede. Tanto que os fibroblastos, produzidos pela ação da
lisozima ou pela ação da penicilina sobre as bactérias Gram-positivas, não
conseguem reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Assim, a reação
de Gram é essencialmente o resultado da interação do complexo cristalino
violeta ou violeta e iodo, com o
peptidoglicano da parede celular, em uma combinação ainda pouco compreendida em
que a presença do ribonucleato de magnésio garante a coesão da parede celular.
5.
Sendo o Gram um método de coloração diferencial,
como esta reação pode ser empregada para a verificação
do estado de pureza de uma
determinada cultura?
A realização periódica do
exame de uma cultura pura demonstra que todas as colônias apresentam a mesma característica de fixação do corante.
6.
Comente o efeito da penicilina sobre a parede
celular bacteriana, correlacionando-o com a reação tintorial de Gram.
A penicilina agem
sobre a parede celular, causando ruptura e consequentemente altera todas as
características morfotintorial observada na coloração de Gram.
7.
Comente a frase: “Uma bactéria Gram-negativa pode
tornar-se Gram-positiva, dependendo do tempo
de incubação da cultura, mas o inverso
não é verdadeiro”
A característica
tintorial de Gram-negativa é devido a presença da membrana externa, que pode
ser perdida em certas condições de cultivo desfavorável, fazendo com que a
bactéria apresente característica de Gram-positiva (roxa), mas o contrário não
é possível porque uma bactéria Gram-positiva jamais adquire a membrana externa,
ou seja, uma vez, Gram-positiva, sempre Gram-positiva.
Coloração de Ziehl Neesen
A coloração ou técnica de Ziehl-Neelsen, abreviada na literatura muitas vezes como ZN, é uma técnica de coloração de bactérias mais agressiva que a técnica de Gram, sendo usada em bactérias que não são bem coradas com esta técnica, como os bacilos da lepra e da tuberculose, as bactérias dos gêneros Mycobacterium e Nocardia, entre outros. Foi desenvolvida por Franz Ziehl e posteriormente melhorada por Friedrich Neelsen, no final do século XIX.
▪ Fixar a lâmina com o calor;
▪ Cobrir o esfregaço com fucsina fenicada;
▪ Aquecer em chama até emitir vapores. A partir disto, iniciar a contagem de cinco minutos;
▪ Lavar suavemente a lâmina em água;
▪ Colocar álcool-ácido clorídrico, até que o corante não se desprenda mais (cerca de dois minutos);
▪ Lavar a lâmina com água;
▪ Cobrir o esfregaço com azul-de-metileno (durante trinta segundos);
▪ Lavar a lâmina com água;
▪ Deixar secar e observar ao microscópio com a objetiva de imersão.
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