As técnicas de semeadura são o método pelo qual se transfere inóculos bacterianos de um meio de cultura ou material a ser analisado (secreções, alimentos) para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, são utilizadas as técnicas assépticas: procedimentos que devem ser adotados visando a não contaminação de materiais, meios e culturas.
Objetivo: Desenvolver as técnicas básicas de semeadura de material para isolamento de
germes
Princípio: Uma população microbiana, sob condições naturais, contém muitas espécies
diferentes. Os microbiologistas devem ser capazes de isolar, enumerar, e identificar os
microrganismos em uma amostra, para então classificá-los e caracterizá-los.
Os microrganismos na natureza normalmente existem em cultura mistas, com
muitas espécies diferentes ocupando o mesmo ambiente.
Ao determinar as características de um microrganismo, ele deve estar em cultura
pura, ou seja, em que todas as células na população são idênticas no sentido de que elas
se originaram de uma mesma célula parental.
Em laboratório, os microrganismos são cultivados ou desenvolvidos em material
nutriente denominado meio de cultura. O tipo de meio utilizado depende de vários
fatores :
➵Considerações sobre a origem do material a ser analisado
➵Espécie que se imagina estar presente nesta amostra
➵As necessidades nutricionais dos organismos
Material: Alça de platina, meio sólido em placa (ágar Mueller-Hinton, ágar sangue,
EMB, etc.,), tubos contendo 10ml de meio Mueller-Hinton, pipetas de 1ml, tubos com
4,5ml de salina estéril, alça de Drigalsky, bico de Bunsen, swab esteril, galeria para tubos
de ensaio, placas de Petri estéreis, becker de 100ml com álcool, estufa a 37ºC, banho-maria a 100ºC, material biológico (saliva, sec. nasal, sec.ouvido, sec.orofaringe, fezes,
urina, etc.).
Métodos:
Técnica de Esgotamento
Transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A placa é dividida em 4 quadrantes e a inoculação pode ser feita de 2 tipos:
• 3 estrias: estriar em metade da placa, com movimentos de zig-zag. Quando atingir a metade, girar a placa 90° e estriar até a metade (1/4 da placa), girar mais 90° e estriar o meio restante.
• 4 estrias: estriar até 2/3 da metade da placa, girar 90°, estriar 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa),
girar 90°, estriar mais 2/3 do próximo quadrante (1/4 da placa), girar 90° e estriar o restante do meio. Objetivo: obtenção de colônias isoladas. É importante não cruzar as estrias (não tocar a alça na estria anterior), para reduzir o inóculo a cada estria e obter as colônias isoladas. Pode-se, alternativamente, flambar a alça entre as estrias e tocar a ponta da estria anterior, arrastando um pequeno inóculo para a próxima estria.
Espalhamento "Pour Plate"
Transferir 1 ml da cultura para placa de Petri vazia, colocar 10 – 20 ml do meio fundido (e resfriado a cerca de 45 – 50°C) sobre a cultura e homogeneizar suavemente com movimentos circulares.
Objetivo: contagem bacteriana. É utilizado também para análise de microrganismos anaeróbios, adicionando uma outra camada de meio fundido após o endurecimento da primeira camada.
Estria simples: transferir uma alçada da cultura para meio sólido em placa e estriar com a alça bacteriológica sobre o meio. A estria pode ser realizada em movimento de zig- zag (estria sinuosa) ou como uma linha reta sobre o meio (estria reta).
Objetivo: Essa técnica é muito utilizada para visualização de determinadas propriedades metabólicas, como a produção de enzimas hidro líticas (hidrólise de substâncias do meio - gema de ovo, sangue...), e produção de pigmentos.
O que precisa ser feito para a execução de uma boa semeadura?
Para execução de uma boa semeadura, certas precauções especiais devem ser
observadas pelo manipulador, com o fim de preservar a pureza do cultivo e minimizar os
riscos de infecção ou intoxicação no Laboratório:
• Todo processo deve ser feito em ambiente limpo e desinfetado, próximo de uma
chama “azul” de um bico de Bunsen, ou então dentro de uma câmara de fluxo laminar;
• Alça de platina utilizada para semear, deve ser flambada antes e depois da semeadura;
• As placas semeadas devem ser incubadas com tampa invertida para não haver
transpiração do meio sobre a tampa
• Regular a entrada de ar do bico de Bunsen, para obter uma chama azul ( zona de
esterilidade );
• Os tubos ou recipientes com meios de cultura, estéreis ou com material a ser
inoculado, deverão ser abertos ou manipulados, somente na proximidade da chama
do bico de Bunsen (zona estéril);
• As manipulações devem ser feitas, preferencialmente, por trás da chama do bico de
Bunsen.
• As alças ou agulhas, de platina ou níquel-cromo, devem ser flambadas imediatamente
antes e depois de qualquer transferência. Elas devem ser flambadas em todo seu
comprimento, a partir de alguns centímetros do cabo de Kolle, até ao rubro,
mantendo-as em posição vertical à chama do bico de Bunsen. Nunca iniciar a
flambagem pela extremidade livre da alça ou agulha. Deixar esfriar nas proximidades
da chama;
• Passar, ligeiramente, dentro da chama do Bico de Bunsen, imediatamente antes e
depois da transferência, pipetas graduadas estéreis, pipeta Pasteur, ou alça de
Drigalsky;
• Nunca abrir ou deixar aberto verticalmente os tubos ou frascos com culturas, incliná-los a aproximadamente em ângulo de 30º;
• No caso de tubo com ágar inclinado, este deve ficar de preferência na horizontal.
Flambar também a boca dos tubos ou frascos contendo culturas e meios,
imediatamente antes e depois da transferência;
• Nunca depositar a tampa ou tampão de algodão dos tubos ou frascos sobre a bancada
ou mesa de trabalho;
• Descartar pipetas usadas em recipientes contendo soluções detergentes ou
desinfetantes;
• Tratar de dispor o material de trabalho em posição adequada à fácil manipulação, sem
riscos de acidentes ou trocas. Manter os tubos, alças e agulhas sempre na posição
vertical, em suportes e estantes apropriadas;
• Identificar adequadamente o material de trabalho.
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